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    分光光度計里的比色法分類

    點擊次數:290 更新時間:2024-05-13
    總述
     
    一般有BCA,Bradford,Lowry等幾種方法。
     
    Lowry法
     
    以最早期的Biuret反應為基礎,并有所改進。蛋白質與Cu2反應,產生藍色的反應物。但是與Biuret相比,Lowry法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時間較長;容易受到非蛋白物質的影響;含EDTA,Tritonx-100,ammoniasulfate等物質的蛋白不適合此種方法。
     
    BCA
     
    (Bicinchoninineacidassay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2反應產生Cu,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系強,反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法,操作簡單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。
     
    Bradford法
     
    這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應,產生的有色化合物吸收峰595nm。其的特點是,敏感度好,是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍;操作更簡單,速度更快;只需要一種反應試劑;化合物可以穩定1小時,方便結果;而且與一系列干擾Lowry,BCA反應的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。
     
    某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致,感到迷惑,究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一,所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如:Keller等測試人奶中的蛋白,結果Lowry,BCA測出的濃度明顯高于Bradford,差異顯著。即使是測定同一樣品,同一種比色法選擇的標準樣品不一致,測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質,以BSA作標準品,濃度1.34mg/ml,以a球蛋白作標準品,濃度2.64mg/ml。因此,在選擇比色法之前,是參照要測試的樣本的化學構成,尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外,比色法定量蛋白質,經常出現的問題是樣品的吸光值太低,導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是,反應后1011分光光度計的重要配件——比色杯的顏色是有一定的半衰期,所以每種比色法都列出了反應測試時間,所有的樣品(包括標準樣品),都必須在此時間內測試。時間過長,得到的吸光值變小,換算的濃度值降低。除此,反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外,非常重要的是,是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯,因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色。
     
    UV法
     
    這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在一些雜質,一般要消除320nm的“背景”信息,設定此功能“開”。與測試核酸類似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時,發現讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上,只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數,只要吸光值有少許改變,濃度就會被放大,從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
     
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